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利用ACDLabs AutoChrom軟件及統計學進行基于ICH Q14的有關物質分析方法開發
更新時間：2024-12-21
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摘要：本文旨在介紹一種基于ICH Q14指南的有關物質分析方法開發流程，該方法利用ACD/AutoChrom 軟件和統計學工具來開發HPLC分析方法和驗證分析方法的耐用性范圍。通過案例研究某主成分及其雜質的分析，展示了如何確保方法的專屬性、準確度和靈敏度及確定合理的耐用性范圍。
引言
在藥物開發過程中，有關物質的分析是確保藥品質量的關鍵步驟。ICH Q14指南提供了一個關于方法開發的框架，要求分析方法必須滿足專屬性、準確度和靈敏度等要求。本文通過某主成分的案例，詳細描述了按照ICH Q14要求如何利用ACD / AutoChrom 軟件和統計學方法來開發和驗證HPLC分析方法。
方法開發范圍及目的
目的：某主成分是一種原料藥，本研究旨在開發一種分析方法，用于檢測該主成分中的已知和未知雜質，確保產品質量。
開發范圍：包括Imp. 1、Imp. 2、Imp. 3、Imp. 4、Imp. 5、Imp. 6等已知雜質以及未知雜質和總雜質。
分析目標概況
方法開發過程
知識準備和風險分析：
基于對化學結構、色譜知識及ACD/Labs軟件對該產品的有關物質進行分析方法開發，確保各組分的專屬性、靈敏度及準確性。
PH的確定：利用ACD/Labs軟件預測該主成分及各雜質的log D
各組份在pH 0-11范圍內log D均大于1，無保留的風險，且不受pH影響，考慮到大多數色譜柱的pH耐用性，pH確定為2.0~8.0范圍。
檢測波長的確定：使用DAD，獲得各組份的DAD數據，如下圖。
通過DAD圖進行對比，選擇230nm波長作為該分析方法的檢測波長。
分析方法篩選部分：
色譜柱的選擇：由于各組份主要結構差異為苯環上取代基，本次篩選了Inertsil ODS-3，Welch Xtimate C18, Phenomenex Kinetex-BiPhenyl，最終確定了Phenomenex Kinetex-BiPhenyl 作為本方法中的色譜柱。
流動相的選擇：弱洗脫，本方法中pH的選擇范圍在2.0-8.0，經過篩選，選擇0.1%磷酸溶液為弱洗脫。強洗脫，部分雜質的Log D約為5，經過篩選選擇及乙腈作為流動相，梯度洗脫。
篩選獲得的方法中發現有一個未知工藝雜質與不同已知雜質有較多的分離問題，是本方法的主要的專屬性方面的風險。
色譜方法優化和初步鑒定：
1、使用一臺儀器（A品牌），設計兩個梯度，三個柱溫（25℃、30℃、35℃）的兩因素梯度優化實驗
洗脫梯度 1：
洗脫梯度 2：
根據以上條件得到的圖譜，使用 AutoChrom 軟件進行建模，模型如下：
從模型分析，隨著柱溫的升高以及更緩（增加一個梯度拐點）的洗脫梯度，未知雜質出峰位置會相對主峰、Imp.2和 Imp.3發生較大后移。在柱溫40℃及以下洗脫梯度（表一）時，未知雜質出峰在Imp.3后，分離較好（軟件中顯示分離度：4.4），且柱溫耐用性范圍較寬（可達±5℃），故以柱溫40℃和表一梯度作為初步確認的中心點實驗條件，在相同品牌不同設備編號的儀器上進行方法確認實驗。
表一：梯度表（柱溫40℃）
2、使用中心點實驗條件在相同品牌不同設備編號的儀器上進行重現，圖譜如下：
不同設備編號實驗結果表：
解析：儀器2與儀器3實驗結果，Imp.3與未知雜質實際分離度和軟件模擬結果重現度高，而儀器1相對另外兩臺儀器，主峰保留時間提前了近兩分鐘，同時Imp.3與未知雜質分離最差。其原因可能與泵和管路的差異有關。
3、為了確保后續方法在不同儀器能有較好的重現性，在分離最差的儀器（儀器1）上重新進行梯度溫度雙因素建模，設計洗脫梯度和三個柱溫（25℃、35℃、45℃）進行兩因素實驗以建立數據模型， 洗脫梯度如下表：
洗脫梯度 1：
洗脫梯度 2：
根據以上條件得到的圖譜進行建模，模型如下：
基于儀器1上的建立的新模型，并比較在原方法開發的儀器上建立的模型，重新調整中心點的位置到柱溫35℃及以下洗脫梯度（表二）。此時未知雜質與Imp.3分離較好（軟件預測分離度：5.2），且柱溫耐用性范圍較寬（可達±5℃），故以柱溫35℃和表二梯度作為中心點實驗條件，在儀器1上進行實驗。
表二：梯度表（柱溫35℃）
4、使用中心點實驗條件在相同品牌不同設備編號的儀器上進行重現
儀器1上中心點實驗加雜溶液（主成分：1mg/ml，各雜質：1μg/ml）圖譜如下：
解析：經過實驗發現，Imp.3 與未知雜質實際分離度為：5.7，和軟件模擬重現度好，結合原模型獲得的空間，調整中心點，確定使用該梯度條件及柱溫為 35℃。
方法耐用性范圍的確定：
利用AutoChrom 軟件進行耐用性預測，并使用統計學軟件（JMP）對方法參數的范圍和相互作用進行探索，建立耐用性空間。
下表展示了選取的變化因素及高低水平的設置，在AutoChrom 軟件中預測出如下條件變化產生243個實驗組合的最小分離度。
利用JMP對方法參數的范圍和相互作用進行探索，將AutoChrom 軟件中模擬出243個實驗的最小分離度導入統計學軟件（JMP），進行處理得到如下結果：
解析：由預測值-實際值圖可以得出，本數據模型RSq值為0.95，模型準確度較高，故AutoChrom 軟件模擬預測出的243個實驗結果具有參考意義，上表設定的條件范圍為耐用性空間范圍；由預測刻畫器圖可以看出，有機相起始比例、有機相終止比例、柱溫和流速對于分離度有影響，其中柱溫的影響是顯著的，由模型數據和統計學處理結果可以初步確定本方法在柱溫35℃，流速為1.2ml/min，洗脫梯度為如下表格。
在此數據模型下，探索統計學軟件（JMP）對于方法開發階段的幫助，在預測刻畫器中，使用設計空間刻畫器，設置我們所需要達到的低分離度，可以得到我們滿足分離要求的空間，由于本方法模型數據均符合分離要求，在此設計一個較大的分離度要求（分離度≥2.5）
解析：在設計空間刻畫器中可以看到，模型數據中滿足分離度要求（分離度≥2.5）的條件占比在97.56%，如需找到一空間使所有分離度均≥2.5，可繼續內移。
解析：在內移至所有條件均滿足分離度要求（分離度≥2.5）時，此時的方法為耐用性范圍為：有機相起始比例（28±1%）、有機相終止比例（32±1%）、梯度洗脫時間（25±1min）、柱溫（30~37℃）及流速（1.2±0.1ml/min）；在此基礎上將限值發送到模擬器對耐用性范圍進行驗證。
解析：由模擬器模擬后得到，耐用性范圍與設計空間刻畫器一致。
從實際出發，以實驗為基礎來論證本方法耐用性空間，在對分離影響較大的各個因素中取邊界點，利用統計學軟件進行實驗設計，設計出12針處于耐用性空間邊界的12個色譜條件，如下表格：
并且在儀器1進行實驗，實驗數據如下：
解析：在耐用性空間邊界點的12個色譜條件下，Imp.3與未知雜質分離均較好，主峰及其他已知雜質與相鄰峰分離也較好。
為了進一步確保此方法在不同品牌儀器間差異，再從統計學軟件設計的12個色譜條件中選擇序號1、2、3、7、9和10色譜條件（每個因素的高低水平都各有三個實驗條件，相當于也是均勻分布在耐用空間上的6個點），在不同品牌儀器進行實驗，圖譜如下：
解析：在不同品牌儀器中，6個色譜條件下，主峰和已知雜質與相鄰峰分離均較好，本方法耐用性空間建立成功。
耐用性范圍為：有機相起始比例（28±1%）、有機相終止比例（32±1%）、梯度洗脫時間（25±1min）、柱溫（35±5℃）及流速（1.2±0.1ml/min）。
結論
本研究成功開發了一種基于ICH Q14的HPLC分析方法，用于某主成分及其雜質的檢測。利用ACD/ AutoChrom 軟件和統計學工具，優化了色譜條件，確保了方法的專屬性、準確度和靈敏度，并建立了方法的耐用性空間。
Kinetex Biphenyl
• 出色的分離能力
• 耐用且可靠
• 100 % 水溶液穩定
具備 C18 無法提供的選擇性！
不僅僅只是高性能和強保留，Kinetex Biphenyl 還擁有傳統 C18 色譜柱無法媲美的能力。可提供具有固定相的核-殼顆粒所帶來的高性能，這種固定相能夠為反相方法開發中改善選擇性的優選。使用 Kinetex Biphenyl 色譜柱可增強保留能力，獲取更高的靈敏度和整體結果；尤為適合芳香族化合物的分析。
芳香族 π-π 相互作用
在聯苯基的芳環和目標分子的芳環以及 π 電子之間
疏水性相互作用
發生在 Biphenyl 配體的碳骨架與目標分析物之間
弱離子或偶極-偶極相互作用
雙環結構產生的高電子密度能夠發揮類似于弱陽離子交換劑的作用，從而增強堿性分析物的保留能力。
